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    论文:鸡蛋清水解物对亚硫酸钠诱发的 疲劳斑···

    (1 *南京蛋生生物科技研究院,南京211800;)(2.上海理工大学食品科学与工程研究所,上海 200082;)摘要:本实验研究了鸡蛋清水解物(HEpep)对斑马鱼的疲劳改善作用。将斑马鱼随机分为6组,分别为空白对照组(养育用水处理)、疲劳模型对照组、中华跌打丸组以及3个HEpep浓度组。28℃培养箱中培养一段时间后,除空白对照组外,其余组均同时水溶给予亚硫酸钠以诱发斑马鱼疲劳模型,然后水溶给予中华跌打丸(1 mg/mL)处理阳性对照组,分别以水溶给予111, 333和1000 μg/mL浓度的HEpep处理HEpep剂量组。养鱼一段时间后,利用行为分析仪测定斑马鱼的运动总距离,并用凝胶渗透色谱测定了HEpep的分子量以及氨基酸含量。结果显示:HEpep分子量668以及303的肽段占比最大,分别占25%以及48%;必需氨基酸占氨基酸总量接近36%,必需氨基酸与非必需氨基酸比例为0.56;支链氨基酸(亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸)含量丰富,高达15.93 mg/g。与疲劳模型对照组比较,中华跌打丸组运动改善作用为115.2%; 在 111、333和1000 μg/mL浓度的浓度条件下,其运动改善作用分别为72.5%、16.9% 和1.9%,乳酸含量分别降低63.2%、18.8%和5.1%。该结果表明,HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力有明显的改善作用,可以显著性降低斑马鱼体内乳酸含量。HEpep作为疲劳改善剂使用时,推荐适宜浓度范围为 0–111 μg/mL。关键词:鸡蛋清水解物;氨基酸;斑马鱼;疲劳Improvement of Egg White Hydroysate on Fatigue Zebrafish Induced by Sodium SulfiteWANG Yu1*, LIU Caiyun2(1*.Nanjing Egg Biotechnology Research Institute, Nanjing 211800, China) (2.School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China;)Abstract: Effect of egg white hydroysate (HEpep) on fatigue zebrafish induced by sodium sulfite was investigated. Zebrafish were randomly divided into six groups: blank group, fatigue model group, Zhonghua Dieda pill group and three concentrations of HEpep group. After incubation at 28℃, except for the blank group, all the other groups were treated by sodium sulfite to induce zebrafish fatigue model. Then Zhonghua Dieda pill at a dose of 1 mg/mL, and HEpep at doses of 111, 333 and 1000 μg/mL was used to treat the fatigue zebrafish respectively. After incubation, the total movement distance of zebrafish was measured by behavior analyzer. The molecular weight and amino acid content of HEpep were also measured. Results showed that molecular weight of 668 and 303 in HEpep accounted for the largest, 25% and 48% respectively; The proportion of essential amino acids to total amino acids was close to 36%, the proportion of essential amino acids to non-essential amino acids was 0.56, branched chain amino acids (Leu + Ile + Val) were rich in HEpep, up to 15.93 mg/g. The total movement distance of zebrafish in Zhonghua Dieda pill group was 115.2% of improvement compared with the model group; In the group treated by HEpep at doses of 111, 333 and 1000 μg/mL, the improvement rate of movement distance was 72.5%, 16.9% and 1.9% respectively, the decrease rate of lactic acids content was 63.2%、18.8% and 5.1% respectively. The results indicated that HEpep could significantly improve the exercise ability and decrease lactic acid content of fatigue zebrafish induced by sodium sulfite. The optimum concentration of HEpep is 0 – 111 μg/mL when it’s used as a fatigue improver. Key words: egg white hydrolysate; amino acid;zebrafish; fatigue通讯作者:王玉,1990年生,女,博士研究生,研究方向:鸡蛋生物功能性开发、特医食品研究与开发。疲劳是持久或过度劳累后造成的身体不适及工作效率减退的现象[1]。长期以来众多学者期望能寻找到一种安全、有效、无毒副作用的方法来有效的延缓疲劳的发生和加速疲劳的消除[2]。鸡蛋清蛋白质氨基酸模式与人体的最接近,生物利用率高,被认为是蛋白质的理想来源。蛋清蛋白经过一种或多种酶水解后形成具有生物活性的肽段,可在食品工业和医药行业方面发挥极大作用[3,4]。目前发现的鸡蛋中的生物活性肽包括降血压肽、抗菌肽、抗氧化肽、免疫调节肽以及促进脑部健康肽等[5-9]。 斑马鱼是一种新型模式脊椎动物,具有繁殖能力强、生殖周期短、胚胎透明、能在显微镜下进行实时观察等特点。其基因与人类基因有着87%的相似性,它们的编码蛋白结构相似而且在生物体内发挥类似的功能、被美国食品药品监督管理局列为继人和啮齿类鼠之后的第三大模式生物,已广泛应用于生命科学研究[10-11]。本研究利用行为分析仪测定斑马鱼的运动总距离,以统计学意义确定了HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动的改善作用, 旨在探索鸡蛋清水解物的新的应用方向。1 材料与方法 1.1 原料 斑马鱼(品种:野生AB系);HEpep(厚德食品股份有限公司);亚硫酸钠、NaOH溶液、柠檬酸(阿拉丁试剂(上海)有限公司);中华跌打丸(广西梧州制药(集团)股份有限公司);乳酸测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所)。1.2 主要仪器设备 V3行为分析仪 ViewPoint Life Sciences;SPX-250B-Z生化培养箱 博迅实业;Waters 1525高效液相色谱仪;L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司; 1.3 试验方法 1.3.1 HEpep的制备工艺HEpep制备工艺:蛋清蛋白→酶解→酶解液→膜分离→浓缩喷雾干燥→蛋清蛋白肽。1.3.2 HEpep分子量大小的测定HEpep分子量大小的测定采用Waters 1525高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和Empower工作站GPC软件),色谱柱为TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm、流动相为乙腈/水/三氟乙酸= 45/55/0.1(V/V/V)、检测波长为220 nm、流速为0.5 ml/min、柱温为 30℃。1.3.3 HEpep氨基酸含量的测定氨基酸含量:用日立L-8900全自动氨基酸分析仪测定。1.3.4 斑马鱼仔鱼的准备斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质:每1L反渗透水中加入200 mg速溶海盐,电导率为 480~510 μS/cm;pH为6.9~7.2;硬度为53.7~71.6 mg/L CaCO3),实验动物使用许可证号为:SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。野生型AB品系斑马鱼,以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后4天(4 dpf),共180尾,每实验组为30尾,用于确定HEpep抗疲劳作用的最大检测浓度(MTC)。野生型AB品系斑马鱼,以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后4天(4 dpf),共180尾,每实验组为30尾,用于HEpep抗疲劳作用评价。1.3.5 确定HEpep的最大检测浓度(MTC)随机选取180尾受精后4天(4 dpf)野生型AB品系斑马鱼,每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼,分别水溶给予HEpep 250、500、1000、2000和4000 μg/mL浓度,同时设置正常对照组(即养鱼用水处理斑马鱼),每孔(实验组)容量为5 mL,置于28℃培养箱中培养1天至5 dpf。实验结束后,观察记录斑马鱼的死亡数量和毒性情况,确定HEpep对斑马鱼的最大检测浓度(MTC)。1.3.6 HEpep对斑马鱼运动的影响随机选取180尾受精后4天(4 dpf)野生型AB品系斑马鱼,每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼,分别水溶给予HEpep 111、333和1000 μg/mL浓度,阳性对照药中华跌打丸1 mg/mL浓度,同时设置正常对照组(即养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组,每孔(实验组)容量为5 mL。28℃培养箱中培养1天至5dpf后,除正常对照组外,其余实验组均用8 mg/mL亚硫酸钠处理5 dpf斑马鱼20 min,以诱发斑马鱼疲劳模型。HEpep和亚硫酸钠共同处理斑马鱼20 min后,每个实验组随机选取10尾斑马鱼,利用行为分析仪,测定斑马鱼的运动总距离(S),以统计学意义评价HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动的改善作用。HEpep对斑马鱼运动能力改善作用计算公式如下:运动能力改善作用(%)=(S-SM)/( SC-SM)*100%S:供试品组;SM:模型对照组;SC:正常对照组1.3.7 运动后斑马鱼乳酸含量测定[12]用乳酸测试盒按步骤加样后可见光分光光度计测其吸光值(波长530 nm), 制作乳酸含量的标准曲线。在低温环境中,将运动后的模型斑马鱼、阳性对照组(用中华跌打丸处理)以及HEpep 3个浓度(111, 333和1000 μg/mL)处理后的斑马鱼用10倍生理盐水制成匀浆液,离心后取上清液稀释5倍后测其吸光值(波长530 nm),通过标准曲线计算得出的匀浆稀释液乳酸浓度(mmol/ L),换算后即得斑马鱼体内乳酸浓度。乳酸含量减少率(%)=(模型斑马鱼乳酸浓度-处理后斑马鱼)/模型斑马鱼乳酸浓度*100%。1.3.8数据处理用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析,p < 0.05表明具有显著性差异。2 结果与讨论2.1 HEpep的分子量鸡蛋清水解物HEpep的分子量检测结果如图1所示。从表1中可知,分子量为668以及303的肽段占比最大,分别占25%以及48%。图 1 HEpep的凝胶渗透色谱图Fig.1 Analytical results of HEpep by GPC chromatopgraphy.表 1 HEpep的凝胶渗透色谱分析结果Table 1 Analytical results of HEpep by GPC chromatopgraphy峰号Peak No.RT(min)MnMwMP面积Area含量Content(%)111.4120486209762237719916133.00214.106297648849855552420.84315.0036513721301616536432.49415.7324242458200323782153.59516.981321137899758855518.88618.086456685401672396625.22719.482793032483186148548.05820.0511713418052562137.932.2 HEpep的氨基酸含量检测结果本研究对鸡蛋清水解物HEpep的氨基酸含量进行了分析,结果如表2所示。可以看出,HEpep中必需氨基酸占氨基酸总量的36%,而且必需氨基酸是非必需氨基酸的0.56倍。根据FAO/WHO,理想蛋白模式中,必需氨基酸应该占氨基酸总量的40%左右,且必需氨基酸应是非必需氨基酸的0.60倍。由此可以得出HEpep的氨基酸模式非常接近FAO/WHO对理想蛋白质的规定,而且HEpep中氨基酸含量高达127.68 mg/g,说明HEpep可以作为一种理想的蛋白质来源。另外,HEpep中支链氨基酸(亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸)的含量高达15.93 mg/g。表 2 HEpep的氨基酸含量检测结果Table 2 Amino Acid Composition of HEpep名称氨基酸含量 mg/g氨基酸总量T mg/g必需氨基酸含量/氨基酸总量 %非必需氨基酸含量/氨基酸总量 %天冬氨酸27.6127.6835.9264.08苏氨酸*4.47丝氨酸7.15谷氨酸18.75甘氨酸3.86丙氨酸7.72蛋氨酸 *4.13异亮氨酸*5.09亮氨酸*9.46酪氨酸4.5苯丙氨酸*9.38赖氨酸6.62组氨酸2.61精氨酸5.79脯氨酸3.84缬氨酸*6.71*表示人体必需氨基酸2.3 HEpep浓度对斑马鱼死亡率的影响表3表明了HEpep处理后斑马鱼“浓度-死亡率”的实验结果,由表3可知HEpep在250至1000 μg/mL浓度下,未引起斑马鱼死亡,也未见其他明显的毒性表型;然而在2000和4000 μg/mL浓度下,分别诱发11/30和30/30尾斑马鱼死亡,死亡率分别为36.7%和100%,故确定HEpep对斑马鱼抗疲劳作用的最大检测浓度为1000 μg/mL,因此抗疲劳作用正式实验浓度设置为111、333和1000 μg/mL。表 3 HEpep 处理后斑马鱼“浓度-死亡率”实验结果(n=30)Table 3 “Concentration- death rate ” result of zebrafish treated by HEpep(n=30)组别浓度(μg/mL)死亡数(尾)死亡率(%)毒性反应情况正常对照组-0/300未见明显异常HEpep2500/300未见明显异常5000/300未见明显异常10000/300未见明显异常200011/3036.7死亡11尾400030/30100全部死亡2.4 HEpep的抗疲劳作用评价亚硫酸钠可以与水中的溶解氧发生反应,造成环境中缺氧,斑马鱼在缺氧环境中造成疲劳,因此常用于疲劳造模[13]。运动耐力实验是反映机体疲劳最直接、最客观的指标,是机体运动过程中物质代谢和能量代谢的综合体现[14]。阳性对照药中华跌打丸由金不换、半边莲等数十种中草药组成, 具有消肿止痛、舒筋活络、止血生肌、活血驱风的功效[15]。从表4中可知,模型对照组斑马鱼总运动距离(2622 mm)与正常对照组(6505 mm)比较,说明疲劳斑马鱼模型构建成功;阳性对照药中华跌打丸组(1 mg/mL)斑马鱼总运动距离为7097 mm,与模型对照组比较其运动改善作用为115.2%。根据图2所示,中华跌打丸组斑马鱼运动后体内乳酸含量最低(0.003 mmol/g),与模型对照组比较(乳酸含量 0.092 mmol/g),乳酸含量降低 97%,说明中华跌打丸可显著改善亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力, 降低体内乳酸含量。此结果与高华等人的研究结果一致:中华跌打丸能明显延长小鼠负重游泳时间, 降低运动后血清尿素氮的含量, 加快运动后血清乳酸的消除速率, 对缓解机体运动中的疲劳感有积极的作用[16]。HEpep 111、333和1000 μg/mL浓度组斑马鱼总运动距离分别为5439、3280和2697 mm,与模型对照组(2622 mm)比较,其运动改善作用分别为72.5%、16.9%和1.9%, HEpep处理后斑马鱼运动后体内乳酸含量分别为0.034,0.075 和0.087 mmol/g(图2),与模型对照组比较,乳酸含量分别降低63.2%、18.8% 和 5.1%。说明在本实验浓度条件下,HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力有明显的改善作用,而且当HEpep浓度为111μg/mL时,该作用最明显,乳酸含量降低率也最大。当HEpep浓度大于111 μg/mL时(333和1000 μg/m),对疲劳斑马鱼运动改善作用呈现减弱趋势,运动后斑马鱼体内乳酸累积量也呈现上升趋势。该结果提示 HEpep作为疲劳改善剂使用时,适宜浓度范围为 0 - 111 μg/mL,并非剂量越大越好。根据HEpep的GPC分子量分析结果显示,分子量668以及303的肽段占比最大,分别占25%以及48%。研究发现,小分子肽在人体不需消化可直接吸收,能直接参与蛋白质的合成[17]。蛋清蛋白通过酶解作用也可产生具备抗氧化活性的氨基酸,包括半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等[18],可清除体内超氧阴离子和羟基自由基(·OH),维持机体氧化还原平衡[19],降低疲劳感。根据表2结果,HEpep中具有抗疲劳功效的支链氨基酸(亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸)含量高达15.93 mg/g,可能是HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力有明显的改善作用的原因。表 4 HEpep 对疲劳斑马鱼运动能力的影响(n=10)Table 4 Effect of HEpep on exercise ability of fatigue zebrafish(n=10)组别浓度(μg/mL)斑马鱼1 h运动总距离(mm,mean ± SE)运动能力改善作用(%)正常对照组-6505 ± 314-模型对照组-2622 ± 473-中华跌打丸1 mg/mL7097 ± 551***115.2***HEpep1115439 ± 386***72.5***3333280 ± 37916.910002697 ± 4611.9与模型对照组比较:***p < 0.001图 2 HEpep 对疲劳斑马鱼体内乳酸含量的影响 (p < 0.05)(n=10)Fig.2 Effect of HEpep on lactic acid content in fatigue zebrafish (p < 0.05)(n=10)3 结论在本研究中,鸡蛋清水解物HEpep中支链氨基酸(亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸)含量丰富,高达15.93 mg/g。对于亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼,在111、333和1000 μg/mL的浓度条件下,其运动改善作用分别为72.5%、16.9%和1.9%,乳酸含量分别降低63.2%、18.8%和5.1%。HEpep对亚硫酸钠诱发的疲劳斑马鱼运动能力有明显的改善作用,HEpep作为疲劳改善剂使用时,适宜浓度范围为 0 - 111 μg/mL。参考文献[1] MIAO Jian-yin, LIAO Wan-wen, KANG Meng, et al. 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    2020-11-16
    王 玉 刘采云

    走入自然放松心情,感恩公司再接再励——设···

    为了激励设备运行保障事业部为公司做出的突出贡献,公司批准部门组织一次野外拓展训练。2020年7月26日,由公司招聘培训中心与设备运行保障事业部共同组织发起了主题为“走入自然放松心情,感恩公司再接再励”的拓展训练,培训的地点是避暑圣地月龙湾山庄。一路上欢声笑语不断,车上组织了声势浩大的拉歌比赛,大家对此次“感恩之旅”充满了期待。月龙湾山庄山清水秀,景色宜人,队员们置身其中,仿佛来到了神秘的世外桃源。此次拓展训练内容丰富多彩,趣味横生。首先进行“破冰组队”,培养员工的执行力和团队合作意识,全体队员随机分成猛虎和战狼两个战队,在三十分钟之内分别选出队长、确定队歌、队旗LOGO,以及团队口号等,双方进行誓师大会。上午进行了难度较大的战地取水,两队士气高昂,队员们通力合作完成,接下来进行了笑翻天的趣味接力赛,以及火爆的拔河比赛等,中午公司为队员们准备了烤羊等丰盛的午餐。下午队员们进行游泳放松,然后进行充满悬念的游山找宝活动,以及泼水节大战、和“远山的呼唤”等活动。活动的最后全体人员在六米的长卷上签字、写下感言,全体合影留念。为期一天的拓展训练很快结束了,这是充实而快乐的一天,全体队员都积极参与,大家激情四溢,斗志昂扬,展现了良好的精神风貌和团队精神,员工们纷纷表示回去要更加努力的工作,不负公司的厚爱。 在返程的大客车上,大家都意犹未尽,全体队员再次引吭高歌,尽情的释放着激情,拓展训练取得圆满成功。附:活动剪影

    2020-07-28
    厚德食品
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